A seguir são comentadas as questões para as quais foram recebidas mais dúvidas quando disponibilizadas para os usuários Controllab
Pergunta 2: A resposta é a opção 4. A temperatura de transporte e armazenamento das amostras de sangue periférico até o seu processamento deve ser de 18 a 25ºC. É importante que essa temperatura seja rigorosamente controlada e monitorada durante todo o processo pré-analítico. A refrigeração a 4ºC pode estabilizar as células em condições em que o armazenamento pré-processamento seja prolongado, porém, a refrigeração pode afetar seletivamente algumas populações de linfócitos, como os linfócitos T CD4+, e, portanto, não é recomendada para análise de subpopulações linfocitárias. O mesmo vale para temperaturas elevadas, e que também devem ser evitadas(1).
Pergunta 3: A resposta é a opção 3. O gate de linfócitos deve ser realizado utilizando critérios como a dispersão de luz e a expressão de CD45 (SSC x CD45), sendo que a pureza deste gate deve ser controlada para que os resultados, de fato, sejam diretamente proporcionais à população de linfócitos presentes na amostra. Os monócitos são uma das populações que mais contaminam o gate de linfócitos, e na evidência dessa contaminação, é importante que os resultados sejam corrigidos. Dentre os marcadores de linhagem monocítica, recomenda-se a utilização do CD14 no painel de subpopulação linfocitária, sendo que a região de células CD45+CD14 neg atrelada a região de linfócitos deve ser maior ou igual a 95,0%(1).
Pergunta 5: A resposta é a opção 4. A soma das porcentagens referente a todas as populações linfocitárias (linfócitos T, B e NK) deve ser o mais próximo de 100%, mas sabendo que algumas condições clínicas e patológicas podem alterar estas populações, a soma pode variar de +/- 10% do total de 100%. Este critério de consistência é importante, pois reflete diretamente a estratégia e pureza do gate de linfócitos, que deve ser maior ou igual a 95,0%(1).
Pergunta 6: A resposta é a opção 3. Dentre as opções, a única que não deve ser considerada como ponto crítico de execução para subpopulações linfocitárias por citometria de fluxo, é a lipemia na amostra de sangue periférico. Todas as outras opções podem alterar significantemente os resultados.
Pergunta 7: A resposta é a opção 3. Por definição um método é considerado qualitativo quando não apresenta relação numérica mensurável – são ensaios do tipo positivo/negativo e a comparabilidade é feita por meio de análise de concordância. Seu desempenho deve ser avaliado por meio de parâmetros como sensibilidade, especificidade, valores preditivos e eficiência. Já para ensaios quantitativos podem-se utilizar métodos comparativos aceitando como diferença o coeficiente de variação do ensaio(2,3).
Pergunta 8: A resposta é a opção 1. A marcação com CD34 de classe II pode ser utilizada para quantificação de células CD34+, porém o anticorpo de classe II reconhece um alvo particular nas células CD34+ enquanto o anticorpo monoclonal CD34 classe III tem afinidade à todas as variantes glicosiladas da molécula. Tendo em vista essa afirmação, a alternativa 2 onde se lê “A marcação com CD34 de classe II deve ser utilizada, pois ela é capaz de detectar todas as glicoformas de CD34” se torna incorreta, invalidando a alternativa 4 como resposta(1,4,5).
Pergunta 9: A resposta é a opção 3. O coeficiente de variação para a Quantificação de CD34+ deve ser de 10%. Para alcançar essa precisão e sensibilidade, um mínimo de 100 eventos CD34+ deve ser adquiridos. Por exemplo, se a contagem de células CD34+ é de 0,13%, 75.000 eventos devem ser colecionados na região de células CD45+, para podermos obter uma contagem de 100 eventos em região de CD34+(1,4,5).
Pergunta 10: A resposta é a opção 2. O gate em região de células CD45+, definido como leukocyte gate, tem a finalidade de marcar/incluir todas as células hematopoiéticas presentes na amostra, bem como separar os glóbulos brancos dos glóbulos vermelhos em casos de hemólise prejudicada, separar glóbulos brancos de eritroblastos, plaquetas e restos celulares, que são CD45 negativos(1,4,5).
Pergunta 11: A resposta é a opção 3. A viabilidade das células CD34+ deve avaliada pela técnica de citometria de fluxo, incluindo no mesmo tubo os marcadores CD34, CD45 e um corante de viabilidade. O corante 7-amino actinomicina-D (7-aad) confere excelentes resultados neste tipo de análise, e é o marcador recomendado pelo protocolo ISHAGE(1,4,5).
Pergunta 13: A resposta é a opção 2. A técnica de pipetagem reversa é indicada para a pipetagem de pequenos volumes e garante maior precisão do volume a ser transferido. Como a medição de volume é um passo crítico em uma técnica de plataforma única, onde um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado, é essencial a verificação periódica da calibração dos instrumentos que são utilizados no laboratório. A verificação da calibração consiste em estabelecer a relação entre o valor indicado pelo instrumento e o valor efetivamente medido. Portanto a utilização de pipetas calibradas juntamente com a técnica de pipetagem reversa garantem maior precisão e acurácia ao teste.
Gabarito
Pergunta 1 – Opção 2
Pergunta 2 – Opção 4
Pergunta 3 – Opção 3
Pergunta 4 – Opção 3
Pergunta 5 – Opção 4
Pergunta 6 – Opção 3
Pergunta 7 – Opção 3
Pergunta 8 – Opção 1
Pergunta 9 – Opção 3
Pergunta 10 – Opção 2
Pergunta 11 – Opção 3
Pergunta 12 – Opção 2
Pergunta 13 – Opção 2
Pergunta 14 – Opção 1
Pergunta 15 – Opção 2
Elaboradores:
Nydia Strachman Bacal – Médica Hematologista e Patologista Clínica. Laboratório Clínico do Departamento de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein. Centro de Hematologia de São Paulo.
Ana Carolina Apelle Bortolucci – Biomédica. Analista de Laboratório Setor de Citometria de Fluxo. Laboratório Clínico do Departamento de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein.
Laiz Cameirão Bento – Biomédica. Analista de Laboratório Setor de Citometria de Fluxo. Laboratório Clínico do Departamento de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein.
Rodolfo Patussi Correia – Farmacêutico. Analista de Laboratório Setor de Citometria de Fluxo. Laboratório Clínico do Departamento de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein.
Referências Bibliográficas:
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry; Approved Guideline—Second Edition. CLSI document H42-A2 (ISBN 1-56238-640-9). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2007)(1).
www.portal.anvisa.gov.br(2).
www.sbpc.org.br(3).
SUTHERLAND, D. R.; KEENEY, M.; GRATAMA, J. W. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Curr Protoc Cytom, v. Chapter 6, p. Unit 6 4, 2003(4).
Gratama J. et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. 1998;34:128-145 (5).