EDIÇÃO 258 – GABARITO – TITULAÇÃO EM IMUNO-HEMATOLOGIA

TITULAÇÃO EM IMUNO-HEMATOLOGIA

Texto Complementar

O título de um anticorpo é determinado pelo inverso da diluição mais elevada onde se observa aglutinação de pelo menos 1+. Portanto, o título deve ser representado apenas por números (ex:8) conforme figura 1, e não pela fração da diluição onde o mesmo ainda se revelou positivo (1/8). A titulação, em geral, pode ser utilizada para determinação do título de isoaglutininas de doadores e pacientes (anti-A, anti-B), na titulação de aloanticorpos formados por pacientes previamente imunizados e no controle de qualidade de reagentes.

Os títulos de anticorpo anti-D são geralmente utilizados para determinar o grau de aloimunização. Eles podem ser identificados por técnicas laboratoriais altamente sensíveis, como titulação em gel centrifugação. Entretanto, uma vez positivo em gel, o método de reação de aglutinação com diluição em tubo é o indicado pela aplicabilidade e correlação clínica. Os métodos em gel e em tubo não apresentam resultados similares e a correlação entre os valores do título em gel com os resultados em tubos devem ser avaliados juntamente com a clínica do paciente.

É necessário que toda avaliação de título de anticorpos dos pacientes, principalmente de gestantes, os resultados devem ser obrigatoriamente comparados com o último título realizado, permitindo assim, um melhor acompanhamento clínico e laboratorial do paciente (Tabela 1):

Tabela 1: Realização do título de uma amostra (anti-D) de uma gestante realizada em períodos diferentes.

Técnica de titulação em tubo:

1. Identificar uma sequência 10 de tubos 12x75mm como: 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 para uma titulação seriada.
2. Com exceção do tubo 1, adicionar 100µl de salina em todos os tubos.
3. Adicionar 100µl do soro ou reagente a ser testado aos tubos 1/1 e 1/2.
4. A partir do tubo 2 transferir 100µl da mistura para o tubo seguinte sucessivamente.
5. Transferir 100µl da mistura do tubo 512 para um tubo reserva, uma vez que pode haver a necessidade de continuar as diluições.
6.  Adicionar 50µl da suspensão de hemácias contendo o antígeno correspondente ao soro ou reagente a ser testado.
7. Em caso de titulação de reagentes, proceder para a etapa 8. Se a titulação for de um anticorpo de paciente (reativo a 37°C), há a necessidade de incubar previamente todos os tubos a 37°C por pelo menos 15 minutos.
8. No caso de reagentes (Ex: anti-A, anti-B), centrifugar por 15 segundos a 3400 rpm ou 1 minuto a 1000 rpm, realizar leitura imediata e anotar os resultados. O título será determinado pelo inverso da diluição mais elevada onde se observa aglutinação de pelo menos 1+. Em se tratando de titulação de anticorpos irregulares, após a incubação deve-se lavar todas as hemácias 3 vezes com solução fisiológica e após adicionar 1 gota de antiglobulina humana.
9. Após a adição da antiglobulina humana, centrifugar por 15 segundos a 3400 rpm ou 1 minuto a 1000 rpm, realizar leitura imediata e anotar os resultados. O título será determinado pelo inverso da diluição mais elevada onde se observa aglutinação de pelo menos 1+
10. Aos tubos que apresentarem resultados negativo, não esquecer de adicionar hemácias recobertas por IgG para validar a reação. Proceder a etapa 9 e esses tubos devem agora apresentar resultado positivo. Esta reação positiva não é utilizada para o resultado de titulação!

Importância na prática transfusional da titulação de anticorpos

• Monitorar títulos seriados ao longo de uma gestação, permitindo uma estimativa da gravidade potencial para anemia hemolítica perinatal. A elevação rápida do título do anticorpo durante a gestação pode indicar que o feto pode ser afetado;
• De acordo com o anticorpo envolvido, a monitorização do título do anticorpo pode levar a procedimentos diagnósticos adicionais, durante a gestação.
• Na anemia hemolítica autoimune é particularmente importante em termos de avaliação da eficácia terapêutica, dando indicação se o título do anticorpo está ou não diminuindo com a terapêutica prescrita.

Considerações importantes

1. O significado clínico de um anticorpo em uma gestante não é determinado isoladamente pela titulação. É necessário que sua especificidade seja determinada e principalmente a classe desse anticorpo (anticorpos IgM não atravessam a barreira placentária).
2. A capacidade hemolítica de um anticorpo de classe IgG pode variar de acordo com a sua especificidade e capacidade em ativar complemento. O anti-D parece ser apenas o único anticorpo que há correlação de título com gravidade de hemólise, sendo o título 16 considerado crítico.
3. Você deve lembrar que existem outros anticorpos e nem todos necessitam de um alto título para provocar uma grave anemia no feto. O anti-K (Kell) é um bom exemplo para esta situação. Daí a necessidade de identificar o anticorpo antes de realizar o título.
4. Para que a técnica de titulação seja corretamente realizada, especial atenção deve ser adotada quando for transferir um volume de um tubo para o outro. Faça opção por uma pipeta calibrada e não utilize pipeta Pasteur, pois a mesma frequentemente forma bolhas e não permite transferir o volume adequado entre os tubos.
5. As hemácias a serem utilizadas na titulação devem estar na concentração adequada e apresentar fenótipo eritrocitário conhecido. Isto será principalmente importante na titulação em paralelo, ou seja, quando se compara resultados anteriores com o atual, as hemácias utilizadas na titulação anterior e na atual devem ter o mesmo fenótipo.

Elaborador: Alexandre Gomes Vizzoni. Biólogo. Mestrado em Pesquisa Clínica (INI-FIOCRUZ). Coordenador de atividades diagnósticas do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI-Fiocruz). Especialista em Imunohematologia (UFRJ) e proficiência técnica em Imunohematologia (ABHH).

Referências Bibliográficas:

Brizot ML, Nishie EN, Liao AW, Zugaib M, Simões R. Aloimunização Rh na gestação. Disponível em: http://www.projetodiretrizes.org.br/diretrizes10/aloimunizacao_rh_na_gestacao.pdf
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Hospitalar e de Urgência. Imuno hematologia laboratorial / Ministério da Saúde, Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Hospitalar e de Urgência.–Brasília: Ministério da Saúde, 2014. 60 p. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/imuno_hematologia_laboratorial.pdf
Novaretti MCZ. Bonifácio SL, Medeiros VR et al. Dez anos de experiência em controle de qualidade em imuno-hematologia. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. São Paulo,v. 31, n. 3, p. 160-165, 2009. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/rbhh/v31n3/aop5209.pdf
Cunningham FG, Leveno KJ, Bloom SL et al. Obstetrícia de Williams – Guia de estudo. 23ª ed. Editora Revinter.

 

A seguir são comentadas as questões para as quais foram recebidas mais dúvidas quando disponibilizadas para os usuários Controllab

Questão 1: A resposta é a opção 3. A titulação mínima aceitável no controle de qualidade de reagentes imuno-hematológicos, conforme a Portaria 2712 de 12 de novembro de 2013 do Ministério da Saúde, para um reagente monoclonal anti-D é 32. Se o reagente apresentar um título menor deverá ser reprovado para utilização. Valores superiores são aceitáveis, mas a questão não aborda este aspecto.

Questão 2: A resposta é a opção 4. A intensidade de 1+ é determinada como a aglutinação mínima aceitável para a reação entre um antígeno e um anticorpo para determinar o título de um anticorpo. Os outros conceitos aplicados na questão são relativos à avidez, score e potência.

Questão 3: A resposta é a opção 2. A cada remessa recebida do fabricante ou distribuidor, os reagentes imuno-hematológicos devem passar pela inspeção do controle de qualidade. Ainda que o mesmo lote tenha sido previamente analisado, a nova remessa não garante que as condições de armazenagem e transporte foram satisfeitas nesta nova entrega. Dessa forma, se faz necessário a realização do controle de qualidade do reagente. O controle de qualidade realizado pelo fabricante na ocasião da produção do reagente, não desobriga os laboratórios de efetuarem seus próprios controles de qualidade.

Questão 4: A resposta é a opção 2. O título deve sempre ser reportado como um número inteiro, e onde ocorra pelo menos a intensidade de 1+ em sua maior diluição. A reação denominada Weak (fraco) não deve ser considerada para reportar um título. As expressões 1/128 ou 1:128 referem-se à diluição realizada.

Questão 5: A resposta é a opção 1. Aloanticorpos que reagem a 37°C desenvolvidos por pacientes em sua grande maioria são de classe IgG e por isso são nomeados como “incompletos”, ou seja, necessitam da fase de antiglobulina para revelar a aglutinação com o antígeno correspondente. O reagente anti-B é composto por uma IgM (daí a sua capacidade em aglutinar hemácias em temperatura ambiente) e nem sempre apresenta título superior a aloanticorpos produzidos por pacientes. A titulação de uma amostra de paciente pode ser realizada pelo método em gel centrifugação, entretanto, o resultado não pode ser analisado sem a correlação clínica do paciente (este método é mais sensível que a técnica em tubo).

Questão 6: A resposta é a opção 3. O principal meio de diluição utilizado pelos laboratórios na técnica de titulação é a solução fisiológica a 0,9%, em algumas regiões do país denominada como “salina’. A água destilada não deve ser empregada pois vai causar hemólise nas hemácias, enquanto que, a bromelina é uma enzima que potencializa reações. A Albumina bovina a 22% é um potencializador macromolecular utilizado nos testes de compatibilidade, pesquisa e identificação de anticorpos. Entretanto, outros potencializadores com melhor desempenho já estão disponíveis para esta finalidade.

Questão 7: A resposta é a opção 1. O título de um anticorpo materno anti-D realizado pelo método em gel centrifugação é usualmente Maior em relação a titulação de anticorpos pelo método em tubo, devido a sensibilidade do teste empregado.

Questão 8: A resposta é a opção 3. Para a realização da titulação de um reagente anti-D não se pode utilizar uma hemácia de fenótipo dccee (RhD negativo). A ausência do antígeno D não permitirá a reação entre o antígeno e o anticorpo (os resultados da titulação serão negativos).

Questão 9: A resposta é a opção 1. O principal interesse clínico na titulação de anticorpos está relacionado ao acompanhamento de grávidas aloimunizadas com anticorpos que apresentam capacidade para causar anemia hemolítica no feto (DHPN). Deve-se considerar monitorar títulos seriados ao longo de uma gestação, permitindo uma estimativa da gravidade potencial para anemia hemolítica perinatal. A elevação rápida do título do anticorpo durante a gestação pode indicar que as hemácias do feto podem ser afetadas pelo anticorpo.

Questão 10: A resposta é a opção 3. Na técnica de titulação é muito frequente o uso de diluição seriada, em que se dilui o soro duas vezes mais a cada tubo (ex.: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256). A quantidade de anticorpos é inversamente proporcional à diluição, ou seja, quanto mais se dilui, menos anticorpos se tem na amostra.

Questão 11: A resposta é a opção 2. A causa mais frequente de resultado falso-negativo no teste da antiglobulina humana é a lavagem inadequada das hemácias. Isso ocorre devido ao fato das globulinas humanas não serem completamente removidas do teste, o que acarretará na fixação do anti-IgG presente no reagente de antiglobulina humana nestas globulinas humanas. Dessa forma, as hemácias revestidas por anticorpos, não terão disponibilidade de anti-IgG para revelarem a aglutinação.

Questão 12: A resposta é a opção 4. O título crítico para anticorpos anti-D produzidos por gestantes é geralmente considerado como 16. Embora existam autores que discordam deste valor, em sua grande maioria, o título de 16 é utilizado para iniciar o monitoramento da gravidade da Doença hemolítica perinatal (DHPN) por anti-D.

Questão 13: A reposta é a opção 3. O termo “anticorpo clinicamente significante” está correlacionado ao potencial do anticorpo acelerar a destruição de hemácias portadoras do antígeno correspondente. Esses anticorpos reagem preferencialmente a 37ºC e são melhor revelados pela técnica de antiglobulina humana. Uma amplitude térmica (abaixo de 22°C) não favorece a reação entre esse tipo de anticorpo com seu antígeno correspondente.

Questão 14: A resposta é a opção 3. O fator de diluição das amostras A e B são, respectivamente 1:100 e 1:10. Ou seja, ao adicionar 10 microlitros (µL) da amostra de soro a 990 µL de solução fisiológica temos um volume final de 1mL. Simplificando a equação por 10, tem-se 1 parte de soro e 99 de solução fisiológica, com um volume final de 100 microlitros (então, se tem 1 parte do soro num total de 100 = 1:100). Essa é a amostra A. Da mesma forma, obtêm-se a amostra B, com 10 µL da amostra A e 90 µL de albumina bovina a 22%. Simplificando a equação por 10, tem-se 1 parte da amostra A e 9 de albumina bovina a 22%, com um volume final de 10 microlitros (então, se tem 1 parte da amostra A num total de 10 = 1:10). Deve-se considerar que a diluição efetuada na amostra A não foi considerada para a realização da diluição da amostra B.

Questão 15: A resposta é a opção 2. O grau de intensidade de 1+, pelo método em tubo, representa vários aglutinados pequenos com o sobrenadante avermelhado. Um botão sólido sem nenhuma célula livre e fundo transparente representa 4+; vários aglutinados grandes com fundo transparente representam 3+ e aglutinados muito pequenos, visíveis apenas ao microscópio são considerados Weak (fraco).

 

Gabarito

Pergunta 1 – Opção 3
Pergunta 2 – Opção 4
Pergunta 3 – Opção 2
Pergunta 4 – Opção 2
Pergunta 5 – Opção 1
Pergunta 6 – Opção 3
Pergunta 7 – Opção 1
Pergunta 8 – Opção 3
Pergunta 9 – Opção 1
Pergunta 10 – Opção 3
Pergunta 11 – Opção 2
Pergunta 12 – Opção 4
Pergunta 13 – Opção 3
Pergunta 14 – Opção 3
Pergunta 15 – Opção 2

Elaborador: Alexandre Gomes Vizzoni. Biólogo. Mestrado em Pesquisa Clínica (INI-FIOCRUZ). Coordenador de atividades diagnósticas do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI-Fiocruz). Especialista em Imunohematologia (UFRJ) e proficiência técnica em Imunohematologia (ABHH).

Referências Bibliográficas:

BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria 2712 de 12 de Novembro de 2013.
Harmening, DM. Técnicas modernas em banco de sangue e transfusão. Editora Revinter, 4ª edição, 2006. 594p.
Castilho, S.; Ubiali, EMA. Carvalho, MA. Controle de qualidade de reagentes em imuno-hematologia. In: BRASIL. Ministério da Saúde. Técnico em Hemoterapia: livro texto. Brasília: Ministério da Saúde,2013. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/tecnico_hemoterapia_livro_texto.pdf