Texto Complementar
SISTEMA RH: A IMPORTÂNCIA DA FENOTIPAGEM RH(D) NA ROTINA LABORATORIAL
O sistema Rh foi descrito em 1939, quando Levine & Stetson verificaram que a causa da “eritroblastose fetal” em um recém-nascido era devida à atividade de anticorpos maternos contra antígenos das hemácias fetais. Posteriormente, Levine & Katzin descreveram esse anticorpo como o mesmo que Karl Landsteiner & Alexander Wierner produziram por meio da imunização de coelhos com hemácias de macacos Rhesus. O antígeno gerador da resposta imunitária foi então chamado de fator Rh.
No total, hoje já foram descritos 54 antígenos1 pertencentes a este sistema, que é o mais complexo de todos os 36 sistemas já descritos, e o mais importante depois do sistema ABO, pois seus antígenos são muito imunogênicos, em especial o antígeno D.
Os anticorpos específicos para os antígenos Rh não estão presentes normalmente nos indivíduos (ao contrario dos anticorpos ABO), e são provenientes de imunização por transfusões ou gestações prévias. São clinicamente significantes e estão envolvidos em reações transfusionais hemolíticas, anemias hemolíticas autoimunes e em casos de doença hemolítica perinatal (DHPN).
Bases Moleculares do Sistema Rh:
Várias teorias genéticas e nomenclaturas foram propostas no passado. Mais modernamente, F. Wagner & W. Flegel propuseram um modelo para o locus Rh onde encontramos dois genes: o RHD e RHCE, que codificam duas proteínas compostas por 417 aminoácidos que atravessam 12 vezes a membrana eritrocitária, denominadas proteínas RhD (onde encontramos os antígenos D e G) e RhCE (onde encontramos os demais antígenos deste sistema).
Os genes são altamente homólogos (“muito similares”), além de estarem presentes no mesmo cromossomo na posição 1p36-34, porém em direções contrárias, e esta proximidade facilita a ocorrência de rearranjos gênicos, deleções e mutações de ponto, que podem ser responsáveis pelo surgimento de algumas variantes de antígenos presentes nas proteínas RhD e RhCE.
Bases moleculares dos fenótipos RhD
Através da análise genômica demonstrou-se que a maioria dos indivíduos Rh(D)+ possui os genes RHD e RHCE, e portanto, possuem expressas nas membranas das hemácias ambas as proteínas. Já o indivíduo Rh(D)- não possui o gene RHD, somente o RHCE.
Os indivíduos Rh(D)- geralmente apresentam a deleção do gene RHD, e consequentemente, não possuem a proteína RhD, porém possuem a proteína RhCE. Uma forma sugerida de representarmos este genótipo seria – – ou _ _ .
Observar que NÃO EXISTE o alelo d do gene RHD!
Existem outros genótipos mais raros associados ao fenótipo Rh(D)-, que não serão objetos deste texto.
Desafios na Fenotipagem RhD
O antígeno D é muito imunogênico, e sua presença ou ausência na superfície da membrana eritrocitária define o indivíduo como Rh(D)+ ou Rh(D)-. Estatisticamente, 80% dos indivíduos Rh(D)- que entram em contato com pequenas quantidades de hemácias Rh(D)+ podem formar anti-D. Além disto, o anti-D é ainda, no Brasil, o anticorpo mais frequentemente associado às DHPN, apesar do emprego da profilaxia utilizando-se a imunoglobulina anti-D ter sido implementada a partir da década de 602 para mulheres grávidas Rh(D)-, ainda não imunizadas com anti-D, e que geraram fetos Rh(D)+.
Hoje a fenotipagem Rh(D) é um grande desafio na rotina laboratorial, e devemos atentar à:
- Escolha de técnicas laboratoriais bem padronizadas, como tubos de ensaio, colunas de aglutinação ou microplacas, não sendo mais indicada a utilização de lâminas de vidro.
- Escolha adequada dos regentes anti-D, que podem ser de origem monoclonal (produzidos em laboratório para reconhecerem especificamente epítopos da proteína) ou policlonal (de origem humana), ou ainda, pode ser compostos por uma mistura de monoclonais.
Estes reagentes podem ser de classe IgM, IgG ou mistura de ambos (blends).
Recomenda-se ainda atentar para que as técnicas empregadas sejam sensíveis para detectar se as variantes fracamente expressas do antígeno D, e os clones dos reagentes serem escolhidos com cautela, preferencialmente combinados a fim de detectar a maioria das variantes parciais (“alteradas”) dos antígenos D. Estes clones estão indicados nas bulas dos reagentes.
Outro “desafio” é compreender a necessidade de incluir-se sempre um controle negativo do teste de fenotipagem RhD, representado pelo reagente denominado “Controle de Rh”, que deve ser de mesma origem e marca que o reagente anti-D.
| [1] Disponivel em http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group-terminology/ acesso em 18-7-2016.
2 A imunoprofilaxia anti-D (IgRh), erroneamente chamada de “vacina”, foi descrita em 1956. Esta imunoglobulina é produzida a partir de uma mistura de plasmas humanos obtidos por plasmaférese de doadores imunizados com anti-D em altos títulos e processados industrialmente. |
Qual sua utilidade?
A fenotipagem Rh(D) caracteriza-se pela reação de uma suspensão de hemácias-teste com o soro anti-D. Geralmente este antissoro contém em sua composição um diluente e um meio proteico: os policlonais continham altas concentrações (22%), e mais modernamente, os monoclonais contêm baixas concentrações proteicas (entre 3-6%). Mas, em ambos os casos, é necessário evitar-se resultados falso-positivos nos testes de hemaglutinação, já que hemácias-teste previamente sensibilizadas por anticorpos podem apresentar aglutinação somente pela presença destas macromoléculas no reagente, e não necessariamente indiquem uma reação específica de antígeno D com o anticorpo anti-D!
Assim, faremos a reação da tipagem Rh(D) com um controle de Rh em paralelo. Este reagente contém apenas o meio diluente do reagente anti-D. Se a reação com o soro-controle Rh for positiva, decorrente da presença eventual de anticorpos aderidos às hemácias ou proteínas séricas anormais, a tipagem RhD é considerada “inválida” e pode ser definida empregando-se antissoro anti-D monoclonal IgM ou dissociando-se estes anticorpos com técnicas adicionais.
Fenótipo Rh(D)+
O indivíduo considerado Rh(D)+ possui os dois genes RHD e RHCE, e portanto, ambas as proteínas. Os indivíduos Rh(D)+ podem ser homo ou heterozigotos para o gene RHD. Aproximadamente 85% da população mundial é constituída de indivíduos Rh(D)+. Mas, dependendo da etnia, podemos encontrar frequências diversas.
A expressão do antígeno D pode variar quantitativa (antígenos fracamente expressos, porém sem alteração em epítopos) ou qualitativamente (com um ou mais epítopos da proteína alterados); isso se deve a mutações no gene RHD. Hoje podemos denominá-los, mais amplamente, como “variantes do antígeno D”, pela impossibilidade de os diferenciarmos nos testes laboratoriais. Mas, independentemente do tipo de gene RHD que o indivíduo possua, estando o antígeno D expresso na membrana eritrocitária, seu fenótipo deverá ser classificado como Rh(D)+. A opção de informar no laudo que trata-se de um antígeno Rh(D) variante ficará sempre a critério de cada serviço.
Variantes do antígeno Rh(D) em indivíduos Rh(D)+
O antígeno Rh(D) é um mosaico de subunidades (ou epítopos).
Antígeno D normal:
O indivíduo Rh(D)+ considerado “D normal” possui todos os epítopos “originais”. Hoje já foram descritos de 30 a 37 epítopos de D.”3,4
Além disto, apresentam um número considerável de sítios antigênicos por hemácias, variando entre 10.000 a 33.000. Por isso, laboratorialmente, nos testes em tubos, os resultados variam entre 4+ a 3+ de aglutinação, e 4+ nas cartelas de aglutinação em colunas.
As variantes do antígeno D incluem os antígenos D fracos e Dparciais (ou categorias).
Antígenos D fracos
MOLECULARMENTE: Em linhas gerais, alterações genéticas promovem alterações na proteína RhD, porém em sua porção transmembranar/ intracelular, e não na região de “epítopos”5. Geralmente, os antígenos Dfraco não produzirão anti-D se expostos a antígenos RhD normais.6 Estas mutações genéticas fazem com que haja uma inserção de menor número de proteínas RhD por hemácia, variando em uma média de 100 a 10.000 sítios antigênicos por hemácia.
SOROLOGICAMENTE: Antigamente designados por Du, definiam as hemácias que reagiam somente com o soro anti-D policlonal quando os testes eram realizados em fase de antiglobulina humana (“fase de Coombs”). Então, a tipagem era liberada como “Rh(D)-Du+”. Esta nomenclatura NÃO é correta, pois hoje não corresponde às bases moleculares já descritas.
Além disto, a determinação sorológica do D fraco dependerá da qualidade do reagente, da técnica empregada (tubo, coluna de aglutinação ou microplacas), ou o uso de enzimas proteolíticas, mas em linhas gerais os antígenos fracos:
– Podem apresentar uma reação de aglutinação fraca com antissoros anti-D já à temperatura ambiente (reatividades de 2+, 1+, W(pó)) pelos métodos em tubo ou microplacas, ou através da observação de fracas aglutinações (menores do que 4+) pelos métodos de aglutinação em coluna7.
– Ou negativa a T.A., sendo potencializada após incubação a 37°C e do uso do soro da antiglobulina humana (“fase de Coombs”) nos testes em tubo.
Recomendamos então, observar atentamente o que vem preconizado na bula dos reagentes empregados para a correta interpretação dos resultados obtidos!
| 3 G. D. Daniels & I. Bromilow, Essential Guide to Blood Groups, cit., p. 38.
4 L. Castilho, em D. T. Covas et al., Hemoterapia: fundamentos e prática (1ª ed. São Paulo: Atheneu, 2007), pp. 137-145. 5 Epítopos do antígeno D são os aminoácidos localizados na porção externa da membrana e, portanto, acessível aos anticorpos. 6 EXCEPCIONALMENTE: em alguns raros casos já descritos na literatura onde as alterações de aminoácidos na proteína RhD alteraram a conformação da proteína, e portanto criaram novos epítopos, e isso supostamente gerou uma alteração passível de ser reconhecida como estranha. Por isso, excepcionalmente em alguns tipos específicos de Dvariantes fracas, o individuo poderá formar anti-D se exposto a antigenos D “normais”. Já foram descritos alguns casos onde inicialmente os indivíduos haviam sido classificados como Dfracos, porém formaram anti-D, como o Dfraco Tipos 4.2.2, 11, 15, 21, 57. 7 Métodos de aglutinação em coluna compreendem as cartelas de gel-teste centrifugação ou colunas contendo pérolas de vidro (métodos atualmente disponíveis no Brasil) |
Antígenos Dparciais ou categorias
MOLECULARMENTE: São caracterizados pela ausência de um ou mais epítopos originais do antígeno D que foram substituídos para outra(s) sequência(s) de aminoácidos. Essas trocas foram promovidas por mutações de ponto missenses (sentido trocado) no gene RHD ou por rearranjos gênicos entre os genes RHD e RHCE, alterando qualitativamente a proteína RhD na porção extracelular. Assim, esses antígenos RhD alterados diferem suficientemente do antígeno RhD normal para permitir a produção de anticorpo anti-D ou mesmo não reagir com alguns reagentes anti-D monoclonais, e ainda podem apresentar-se fracamente expressos (mas nem sempre!).
SOROLOGICAMENTE: O fenótipo D parcial é determinado de acordo com a reatividade obtida com painel de soros monoclonais anti-D.
Nas práticas de rotina sorológica de fenotipagem Rh(D), porém, são de difícil distinção, podendo ser algumas vezes classificados como D fracos ou, ainda, como no caso do DIII, apresentarem-se quantitativamente normais, gerando classificação sorológica errônea; por isso, em alguns casos de indivíduos Rh(D)+ previamente transfundidos ou com histórico de gestações e/ou abortos prévios, podemos encontrar no soro anticorpo irregular anti-D.
Concluindo, a fenotipagem Rh(D) requer bastante rigor técnico e conhecimento para escolha das técnicas e reagentes empregados, e muito cuidado na interpretação dos resultados obtidos. Especialmente tratando-se dos clientes de laboratórios clínicos, doadores de sangue, gestantes e recém-nascidos, onde não podemos correr o risco de serem classificados erroneamente.
FIGURA 1: Modelo esquemático das proteínas Rh, demonstrando os pontos de polimorfismos (coloridos)
| Legenda: – Os pontos em amarelo ou laranja demonstram os aminoácidos alterados nos antígenos Dfracos. – Os pontos azuis claros ou escuros demonstram os aminoácidos alterados nos antígenos Dparciais ou categorias. – Os demais se referem aos polimorfismos na proteína RhCE. |
A seguir são comentadas as questões para as quais foram recebidas mais dúvidas quando disponibilizadas para os usuários Controllab
Conforme observação da elaboradora, algumas questões apresentaram índice de acerto abaixo do esperado por falta de consulta ao texto introdutório do questionário. Muitas vezes as questões para marcar opções correta/incorreta ou “exceção” fazem menção as informações contidas neste texto.
Pergunta 1: A resposta é a opção 3. Não existe a “prova reversa para a tipagem RhD”. A prova reversa, realizada nas tipagens sanguíneas, refere-se à busca de anticorpos naturais e regulares do sistema ABO. Os indivíduos RhD- não formam naturalmente anticorpos anti-D, a não ser por exposição ao antígeno oriundos de transfusões ou gestações RhD+.
Opção 1 – Por definição, os anticorpos monoclonais são produzidos contra um determinado epítopo de um antígeno, sendo, portanto, altamente específicos.
Opção 2 – No Brasil podemos encontrar estes três tipos de antissoros à venda no mercado.
Opção 4 – A tipagem Rh(D) deve ser realizada com um controle de Rh em paralelo. Este reagente contém apenas o meio diluente do reagente anti-D. Se a reação com o soro-controle Rh for positiva, decorrente da presença eventual de anticorpos aderidos às hemácias ou proteínas séricas anormais, a tipagem RhD é considerada “inválida”.
Pergunta 2: A resposta é a opção 2. Os indivíduos que apresentam antígenos Dfraco devem ter seus resultados liberados como RhD+, sendo opcional a adição da observação “Dfraco” ou “D de baixa expressão antigênica”, ou mais modernamente, “Dvariante”
Mas, independentemente do tipo de gene RHD que o indivíduo possua, estando o antígeno D expresso na membrana eritrocitária, seu fenótipo deverá ser classificado como Rh(D)+. A opção de informar no laudo que trata-se de um antígeno Rh(D) variante ficará sempre a critério de cada serviço.
Opção 1 – Para as técnicas realizadas em tubos de ensaio, quando o Rh resultar negativo na fase de temperatura ambiente, devemos prosseguir com a pesquisa de antígenos D fracamente expressos, levando o tubo-teste contendo soro anti-D e também o respectivo controle de Rh, até a fase de antiglobulina humana (Combs), teste antigamente denominado “pesquisa de Du”.
Opção 3 – O teste de controle de Rh deve acompanhar todas as tipagens RhD. Serve como um controle negativo da reação. Em caso de resultar positivo, isto geralmente indicará a presença de anticorpos ligados às hemácias-teste, ou um aumento de proteínas no soro, e testes adicionais deverão ser realizados de acordo com a metodologia empregada (consultar as bulas dos reagentes).
Opção 4 – Se a reação com o soro-controle Rh for positiva, decorrente da presença eventual de anticorpos aderidos às hemácias ou proteínas séricas anormais, a tipagem RhD é considerada “inválida” e pode ser definida empregando-se antissoro anti-D monoclonal IgM ou dissociando-se estes anticorpos com técnicas adicionais.
Pergunta 3: A resposta é a opção 2. Estas mutações genéticas fazem com que haja uma inserção de menor número de proteínas RhD por hemácia, variando em uma média de 100 a 10.000 sítios antigênicos por hemácia.
Opção 1 – Antígenos D fracos. Molecularmente: Em linhas gerais, alterações genéticas promovem alterações na proteína RhD, porém em sua porção transmembranar/intracelular, e não na região de “epítopos”.
Opção 3 – Na impossibilidade de definir-se sorologicamente se a gestante é Dfraco ou Dparcial, é recomendado que a mesma possa entrar no esquema de imunoprofilaxia com a imunoglobulina anti-D.
De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016).
“Receptores Dfracos: A sugestão para evitar imunizações transfusionais ou feto-maternas de indivíduos D parciais fracos (exemplo: DVI) é transfundir sangue Rh(D)- em indivíduo Rh(D)+fraco e fazer prevenção de imunização de mãe Rh(D)+fraco com imunoglobulinas anti-D.
(…)
Como já discutido no capítulo 6 (sistema Rh) existem indivíduos classificados com Rh(D)+ mas podem apresentar o antígeno D parcial e portanto podendo produzir anti-D. Em várias publicações relacionadas aos cuidados do pré-natal, recomenda-se a repetição do fenótipo ABO/Rh por volta da 28ª semana de gestação (onde repete-se também a pesquisa de anticorpos irregulares) com a finalidade de detectar possíveis desvios na classificação ABO/Rh(D). Ainda existe a recomendação do uso de técnicas moleculares para o esclarecimento de casos indefinidos sorologicamente.
Para casos onde não conseguimos esclarecer o fenótipo RhD sorologicamente em tempo hábil, ou em casos onde a mulher apresentar a fenotipagem RhD fraca (Dvariante), e na impossibilidade de determinar se trata-se de uma variante capaz de ser imunizada pelo antígeno RhD, recomenda-se a administração da imunoglobulina anti-D, apesar dessa conduta ainda não possuir consenso na literatura médica pertinente!”.
Opção 4 – Geralmente, os antígenos Dfraco não produzirão anti-D se expostos a antígenos RhD normais.
Excepcionalmente, em alguns raros casos já descritos na literatura onde as alterações de aminoácidos na proteína RhD alteraram a conformação da proteína, e portanto criaram novos epítopos, e isso supostamente gerou uma alteração passível de ser reconhecida como estranha. Por isso, excepcionalmente em alguns tipos específicos de Dvariantes fracas, o individuo poderá formar anti-D se exposto a antigenos D “normais”. Já foram descritos alguns casos onde inicialmente os indivíduos haviam sido classificados como Dfracos, porém formaram anti-D, como o Dfraco Tipos 4.2.2, 11, 15, 21, 57.
Pergunta 4: A resposta é a opção 3.
Opção 1 – Antígenos Dparciais ou categorias.
MOLECULARMENTE: São caracterizados pela ausência de um ou mais epítopos originais do antígeno D que foram substituídos para outra(s) sequência(s) de aminoácidos. Essas trocas foram promovidas por mutações de ponto missenses (sentido trocado) no gene RHD ou por rearranjos gênicos entre os genes RHD e RHCE, alterando qualitativamente a proteína RhD na porção extracelular.
Opção 2 – Nas práticas de rotina sorológica de fenotipagem Rh(D), porém, são de difícil distinção, podendo ser algumas vezes classificados como Dfracos ou, ainda, como no caso do DIII, apresentarem-se quantitativamente normais, gerando classificação sorológica errônea;
Opção 4 – Por concepção, os anticorpos IgM só serão capazes de promover aglutinação a temperatura ambiente se o antígeno D estiver expresso em uma quantidade suficiente. Porém, alguns indivíduos Dparciais apresentam também fracas expressões do antígeno D, sendo reconhecidos apenas na fase de antiglobulina humana, nos testes realizados em tubos de ensaio.
Pergunta 6: A resposta é a opção 4. Visto que representamos a presença do gene RHD como D, e a ausência como _ ou -, João pode ser homo (DD) ou heterozigoto (D-) para o gene RHD.
Opção 1 – Os indivíduos Rh(D)- geralmente apresentam a deleção do gene RHD, e consequentemente, não possuem a proteína RhD, porém possuem a proteína RhCE.
Uma forma sugerida de representarmos este genótipo seria – – ou _ _ .
Observar que não existe o alelo d do gene RHD!
Opção 3 – Resposta comentada:
João ORh(D)+ X Maria ORh(D)-
Genótipos possíveis
João: OO DD ou D- X Maria OO –
F1: 100% OO (Tipo O)
– Se João for homozigoto DD: 100% D- = Rh(D)+
– Se João for heterozigoto D-: 50% D- = Rh(D)+ ; 50% — = Rh(D)-
Pergunta 7: A resposta é a opção 4. Na impossibilidade de definir-se sorologicamente se a gestante é Dfraco ou Dparcial, É RECOMENDADO que a mesma possa entrar no esquema de imunoprofilaxia com a imunoglobulina anti-D.
De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN, (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.)
“Receptores Dfracos: A sugestão para evitar imunizações transfusionais ou feto-maternas de indivíduos D parciais fracos (exemplo: DVI) é transfundir sangue Rh(D)- em indivíduo Rh(D)+fraco e fazer prevenção de imunização de mãe Rh(D)+fraco com imunoglobulinas anti-D (exemplo: Roghan®)”.
Opção 1 – Maria poderá gestar um bebe Rh(D)+, pois tanto ela quanto João possuem pelo menos um gene RHD.
João ORh(D)+ X Maria ORh(D)- Dvariante
Genótipos possíveis:
João: OO DD ou D- X Maria OO DD ou D- (gene RHD variante)
Opção 2 – A fenotipagem Rh de Maria é Rh(D)+ variante. O fato dela ser Dvariante poderá ser informado ao médico obstetra, que poderá decidir por indicar a imunoprofilaxia anti-D.
Opção 3 – A fenotipagem Rh de Maria é Rh(D)+ variante. E o laudo deverá ser liberado com Rh(D)+ . O fato dela ser Dvariante poderá ser informado ao médico obstetra, que poderá decidir por indicar a imunoprofilaxia anti-D.
Pergunta 8: A resposta é a opção 1. A fenotipagem Rh(D) resultou positiva na fase de antiglobulina humana (Coombs), e o controle Rh negativo validou este resultado. Portanto, este indivíduo é considerado Rh(D)+ variante (fraco e/ou parcial).
Opção 2 – O controle Rh está negativo, portanto validou o resultado.
Opção 3 – Na impossibilidade de se classificar sorologicamente se o antígeno Dvariante do receptor de sangue o predisporá a aloimunização em caso de receber concentrados de hemácias Rh(D)+, é recomendado (e portanto, não é obrigatório) transfundir-se sangue Rh(D)-. Mas fica a critério da instituição avaliar cada caso em particular, especialmente tendo-se em vista se o paciente já é politransfundido e se há estoque de hemácias Rh(D)- para atender a solicitação. Vale lembrar: Provas cruzadas negativas não evitam a aloimunização posterior dos receptores que recebem hemocomponentes contendo hemácias. Apenas sinalizam que não há anticorpos presentes no soro /plasma no momento da testagem, ou que os mesmos não estão em títulos detectáveis pelos testes sorológicos!
De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN, (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.)
“Receptores Dfracos: A sugestão para evitar imunizações transfusionais ou feto-maternas de indivíduos D parciais fracos (exemplo: DVI) é transfundir sangue Rh(D)- em indivíduo Rh(D)+fraco e fazer prevenção de imunização de mãe Rh(D)+fraco com imunoglobulinas anti-D (exemplo: Rhogam®)”
Pergunta 9: A resposta é a opção 4. De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN, (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.)
Fisiopatologia da doença hemolítica do recém-nascido ou perinatal
POR ALOANTICORPOS MATERNOS
“Na aloimunização materna, a mãe produz um aloanticorpo contra um antígeno eritrocitário fetal herdado geneticamente do pai, ausente nos glóbulos vermelhos maternos, como se pode ver no esquema da próxima página. Geralmente são anticorpos do sistema Rh, sendo que ainda o anti-D continua sendo o mais frequentemente encontrado, apesar do emprego amplo da imunoprofilaxia anti-D após a década de 70, mas vem decaindo. Com esta diminuição, vem ocorrendo um aumento na incidência de aloimunização por outros anticorpos. Ex: anti-K, anti-c, entre outros.
(…)
Já no caso da DHPN por anti-D, a incidência no mundo vem decaindo gradativamente, após o advento da imunoprofilaxia anti-D. E, em contrapartida, outras especificidades vêm sendo identificadas. Mais de 50 especificidades diferentes de anticorpos já foram relatadas como implicados em DHPN, mas a maioria dos casos severos foi relacionada ao anti-D, anti-c, anti-K. Há ainda diferenças étnicas e raciais relacionadas à ocorrência da DHPN pelos diferentes anticorpos, pois reflete diretamente a frequência dos alelos gênicos na população e a consequente imunização materna. Por exemplo, o anti-D é raramente encontrado nos casos de DHPN em asiáticos, pois o fenótipo RhD- é extremamente raro; enquanto nos caucasianos e afro-americanos, a incompatibilidade Rh(D) ocorre em 10% de todas as gestações.”
Nota da autora: até o momento já foram classificados mais de 350 antígenos presentes nas membranas eritrocitárias, agrupados em 36 sistemas distintos!
Opção 2 – De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN, (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.)
“Anticorpos Rh
Clinicamente significativos por estarem envolvidos em reações transfusionais hemolíticas, anemias hemolíticas autoimunes e doença hemolítica perinatal, quase todos resultam de aloimunização por transfusão ou gravidez, pertencendo geralmente à classe IgG.
Com raríssimas exceções, os anticorpos Rh não se ligam ao complemento quando reagem com seus antígenos específicos, e os mais frequentemente encontrados são os anticorpos anti-D, -E, -c, -C, -e.
Quanto aos testes laboratoriais, reagem otimamente a 37°C e fase de antiglobulina humana.
A reatividade dos anticorpos pode ser exacerbada em testes de pesquisa e identificação de anticorpos irregulares, quando utilizamos hemácias tratadas com enzimas proteolíticas, como papaína, ficina e bromelina.
O antígeno D é altamente imunogênico e, uma vez formado o anti-D, este persiste por muitos anos”.
Pergunta 10: A resposta é a opção 1. Este grau de aglutinação corresponde a 2+, portanto sendo um resultado positivo. O indivíduo deve ser classificado como ARh(D)+, sendo opcional a anotação de que trata-se de um antígeno Dvariante (fraco e/ou parcial).
Opção 2 – Observe a tarjeta abaixo dos microtubos, que indicam trata-se de soros monoclonais. No microtubo destinado à tipagem Rh(D) está escrito DVI-, o que equivale a dizer que este soro monoclonal não detecta a variante DVI, uma das mais comuns no mundo, segundo a literatura mundial, mas não necessariamente no Brasil.
De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN, (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.)
“Segundo dados da literatura mundial, o fenótipo D parcial categoria VI (DVI) é o de maior frequência entre os D parciais e ocorre em razão da ausência da maioria dos epítopos típicos de RhD. Os indivíduos se imunizam facilmente quando transfundidos com hemácias RhD+, produzindo anticorpos anti-D contra os epítopos ausentes.
E isso se confirma no Brasil?
Até o momento, poucos estudos realizados no Brasil demonstraram que há uma grande heterogeneidade na distribuição e frequência dessas variantes”.
Pergunta 11: A resposta é a opção 2. A prova direta exibe uma discrepância com a prova reversa ABO, que pode ser devida a anticorpos aderidos às hemácias (Coombs Direto ou TAD+), assim como o Rh(D) e seu respectivo controle; e a prova reversa pode estar incongruente com a direta devido aos (mesmos) anticorpos livres no plasma.
Neste caso, deve ser realizado o Teste de Antiglobulina Humana Direto (Coombs Direto) a fim de elucidar o caso, e proceder a técnicas adicionais para remoção destes anticorpos.
Na impossibilidade de prosseguir com os testes supracitados, a tipagem deverá ser liberada como “prejudicada” ou “Inconclusiva”.
Opção 1 – Toda a tipagem ABO e Rh(D) está inválida (ou prejudicada). A prova direta exibe uma discrepância com a prova reversa ABO, e a tipagem Rh(D) está inválida pela observação do controle positivo.
Observação importante: Em cartelas de aglutinação em coluna, o controle (CTL) é um controle negativo de todo o teste (toda a cartela), visto que o meio diluente dos antissoros nela contido são os mesmos.
Opção 3 – A presença de hemólise na amostra não interfere nos resultados laboratoriais.
Opção 4 – As provas direta e reversa devem ser concordantes. Além disto, neste caso específico a prova direta não aponta como sendo de grupo “O”, visto que existe aglutinação nos microtubos contendo os antissoros anti-A e anti-B.
Pergunta 12: A resposta é a opção 2. MÃE DE ALICE: ARh- (genótipo ABO: AO/ genótipo RhD: –)
IRMÃO DE ALICE: ORh+ (OO/ D–) : inferido a partir do genótipo materno
ALICE ARh- (genótipo ABO: AA ou AO/ genótipo RhD: –) X suposto pai : possui genes B , D com certeza
FILHO ABRh+ (genótipo ABO: AB/ genótipo RhD: D-)
Pergunta 13: A resposta é a opção 4. De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN, (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.)
“É importante ressaltar, portanto, que não existe consenso quanto ao melhor procedimento de detecção do antígeno Rh(D), devendo-se avaliar o tipo de público-alvo que utilizará esse serviço e qual a finalidade da classificação do fenótipo Rh(D) (doadores, rotina pré-transfusional, ou pré-natal).
Em workshops nacionais e internacionais surgiu a recomendação para a utilização de dois reagentes anti-D para a fenotipagem: uma mistura de monoclonais que detectam os antígenos D fracos e a maioria dos antígenos D parciais; e um monoclonal que não detecte a variante mais comum, que é a categoria DVI, entre outras. Caso não seja possível à utilização de dois reagentes anti-D na rotina de classificação do fenótipo Rh(D), é recomendado utilizar reagente anti-D que detecte a maioria dos epítopos originais do antígeno D normal para a imuno-hematologia de doadores”.
Pergunta 14: A resposta é a opção 1. Análise do caso: Pela tipagem Rh(D) observamos que o resultado obtido foi fracamente positivo. É necessário realizar-se o controle de Rh em paralelo para validar este resultado.
Se o resultado do controle Rh for negativo, a gestante deverá ser classificada como RhD+ (D variante).
O fato do Coombs Indireto (Pesquisa de Anticorpos Irregulares) estar positivo também não corresponde a dizer que a gestante tenha um anti-D em seu soro.
De qualquer forma, o anticorpo irregular está presente, e é necessário proceder sua identificação e avaliar se tem significado para a gestante, especialmente em relação à sua classe, lembrando que somente anticorpos IgG são capazes de atravessar a barreira placentária
– Apesar de ser esta a conduta na maioria dos laboratórios, não é possível afirmar que o anticorpo que a gestante apresenta no soro seja o anti-D, sem identificá-lo através do painel de hemácias.
– Titulação de anticorpos, sem o conhecimento de sua especificidade, é de pouquíssima valia para o clínico.
– Não há consenso na literatura mundial sobre qual seja o título crítico para predizer severidade da hemólise fetal por causa de anticorpos antieritrocitários em gestantes, além do anti-D.
Opção 2 – Ainda é possível considerar que um indivíduo possa formar alguns anticorpos irregulares naturalmente. Estes anticorpos geralmente são IgM e , portanto, não teriam significado clínico em gestações. Como exemplo de especificidades mais comuns de anticorpos irregulares naturais IgM são: o anti-M (*raros casos citados de IgG), -N, -Lea, – Leb, Lua, Lub, entre outros.
Pergunta 15: A resposta é a opção 1. De acordo com GIRELLO, A. L. KUHN, (T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.)
“Sobre a especificidade dos anticorpos:
A mera ocorrência de uma pesquisa de anticorpos irregulares positiva (Coombs Indireto) na gestante não é indício de que a DHPN ocorrerá. Por isso, é importantíssimo sabermos no pré-natal qual a especificidade do anticorpo que a mãe possui, pois desta forma é possível inferir-se a severidade da hemólise das hemácias fetais, e por consequência, alertar ao obstetra para a necessidade de um acompanhamento clínico-laboratorial desta gestação.
Dependendo da especificidade dos anticorpos, estes podem ocasionar graus diferentes de severidade de hemólise das hemácias fetais e diferentes manifestações clínicas e laboratoriais. Isso sugere que o título dos anticorpos e a análise do líquido amniótico não correspondem necessariamente à evolução dos sinais e sintomas!” .
Testes pré-natais na gestante:
RESUMO:
| TESTE | PERÍODO |
| TIPAGEM ABO E RH(D) | Visita inicial
26 – 28 semanas de gestação |
| PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI ou Coombs Indireto) | Standards internacionais recomendam em todas as gestantes, na visita inicial.
Repetir após a 28a semana de gestação. |
| PAI+: Identificação dos anticorpos | Assim que forem detectados. |
| TITULAÇÃO DE ANTICORPOS | Anticorpos anti-D: quando identificado; repetir na 18a– 20a semana de gestação; repetir no intervalo de 2-4 semanas se estiver abaixo do título considerado crítico (16-32). |
| Outros anticorpos: sugere-se avaliar potencial clinico e a titulação será uma decisão do médico obstetra. |
Referência Complementar: Guidelines for Prenatal and Perinatal Immunohematology. AABB Standards, 2005.
Gabarito
Pergunta 1 – Opção 3
Pergunta 2 – Opção 2
Pergunta 3 – Opção 2
Pergunta 4 – Opção 3
Pergunta 5 – Opção 4
Pergunta 6 – Opção 4
Pergunta 7 – Opção 4
Pergunta 8 – Opção 1
Pergunta 9 – Opção 4
Pergunta 10 – Opção 1
Pergunta 11 – Opção 2
Pergunta 12 – Opção 3
Pergunta 13 – Opção 4
Pergunta 14 – Opção 1
Pergunta 15 – Opção 1
Elaboradora: Ana Lúcia Girello. Biomédica e Publicitária, Mestre em Análises Clínicas, Especialista em Design Instrucional, sócia-proprietária da empresa Bioline Assessoria, Consultoria e Treinamento Ltda. (SP), Autora do livro “Fundamentos da Imuno-hematologia Eritrocitária” (GIRELLO, AL. KUHN, TIB. 4a ed. Ed. Senac, 2016.)
Referências Bibliográficas:
BRASIL. Gabinete do Ministro. PORTARIA MS/GM Nº 158, DE 4 DE FEVEREIRO DE 2016. Redefine o regulamento técnico de procedimentos hemoterápicos. Diário Oficial da União; Poder Executivo, Brasília, DF, 5 fev. 2016. Seção 1, p.37-57. Disponível em: http://www.brasilsus.com.br/index.php/legislacoes/gabinete-do-ministro/6350-158. Acesso em 06 set 2016.
GIRELLO, A. L. KUHN, T.I.B. Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial. Ed. Senac. 4a ed., 2016.
VIZZONI, A.G. Fundamentos e Técnicas em Banco de Sangue. 1a ed. Ed. Érica, 2015.