A seguir são comentadas as questões para as quais foram recebidas mais dúvidas quando disponibilizadas para os usuários Controllab
Questão 1: A resposta é a opção 4. O anticoagulante de escolha para a contagem de plaquetas é o EDTA por ser um potente agente quelante de íons cálcio. O EDTA se apresenta em três formas: dissódica (Na2EDTA), dipotássica (K2EDTA) e o tripotássica (K3EDTA). Esta última é a mais utilizada por ser mais solúvel.
Como quelante de cálcio, o EDTA bloqueia a cascata da coagulação e a ativação plaquetária, mas mesmo assim o sangue deve ser coletado em tubo de vidro siliconizado ou em tubo plástico. A carga negativa do vidro promove ativação, adesão das plaquetas, agregação e consequentemente altera o número de plaquetas na amostra analisada.
A pseudotrombocitopenia é definida como falso número de plaquetas ocasionado pela aglutinação “in vitro” das plaquetas quando em contato com o anticoagulante EDTA. A aglutinação das plaquetas pode resultar na formação de grumos de tamanho similar aos dos leucócitos, e o contador automático é incapaz de distinguir tais grumos, reconhecendo-os como leucócitos e fornecendo contagem falsamente elevada ou pseudoleucocitose e pseudoplaquetopenia.
A natureza fisiopatológica da pseudotrombocitopenia induzida pelo EDTA é, ainda, incerta. No entanto, tem sido proposto que autoanticorpos presentes no plasma reconhecem e se ligam a um epítopo da glicoproteína IIb (GPIIb), promovendo a aglutinação das plaquetas. Esse epítopo somente é exposto na presença de EDTA e não de outros anticoagulantes.
A identificação desses artefatos laboratoriais na extensão de sangue periférico em lâmina, quando colhido com EDTA, pode ser bastante difícil em alguns casos, tornando desafiador o diagnóstico diferencial com situações de plaquetopenia real. O uso de algumas alternativas pode ser de grande auxílio no diagnóstico inequívoco das pseudoplaquetopenias, como é o caso da agitação por vórtex para dissolução dos agregados plaquetários e o emprego de anticoagulantes alternativos ao EDTA como, por exemplo, o citrato de sódio 3,2%.
Questão 2: A resposta é a opção 3. O teste Tempo de Sangramento (TS) foi introduzido por Duke nos anos 50 para a avaliação da hemostasia primária, “in vivo”. Com auxílio de uma lanceta, é feita uma incisão no lóbulo da orelha e o sangramento é avaliado de 30 em 30 segundos até a parada. Mais tarde, Ivy modificou o teste realizando pequenas incisões no dorso do antebraço, mantido a uma pressão arterial constante. Com o lançamento no mercado dos chamados dispositivos ou templates, as incisões para o tempo de sangramento passaram a ser padronizadas tanto em relação ao tamanho quanto à profundidade. Porém, mesmo com o uso dos dispositivos o teste de triagem apresenta várias desvantagens, motivo pelo qual está sendo descontinuado na prática clínica. É invasivo, pode promover a formação de queloide, pouco reprodutível, depende do operador, baixa sensibilidade e especificidade à disfunção leve e pouca correlação com a tendência a sangramento. Além disso, é influenciado por vários fatores como, idade, sexo, temperatura da pele, hematócrito, número de plaquetas abaixo de 100.000/mm³ e a direção da incisão.
Questão 3: A resposta é a opção 4. O sangue deve ser coletado após um período de repouso do paciente, para atenuar o efeito da liberação da adrenalina induzida pelo exercício físico, na agregação plaquetária, além do jejum de 4 horas.
Para a coleta adequada é muito importante experiência e destreza do flebotomista. O excesso de manipulação da agulha danifica o tecido, ocasionando maior exposição do subendotélio, liberação de fator tecidual e ativação plaquetária. É recomendável a punção da veia com de agulhas de calibre 21 para os adultos e 23 para crianças e se possível, sem garroteamento.
No caso de veia de difícil acesso, deve ser adotada a técnica de duas seringas para facilitar o descarte dos três primeiros mililitros de sangue. Alternativamente, se o sangue for colhido em tubo a vácuo, o primeiro tubo deve ser descartado.
Para evitar a contaminação indesejada entre os diferentes anticoagulantes o tubo contendo citrato de sódio deve ser o primeiro a ser coletado.
O anticoagulante adequado para o teste de agregação plaquetária é o citrato de sódio 3.2% ou 3.8%, na proporção de 1 volume de anticoagulante para 9 volumes de sangue. Nos casos em que o hematócrito estiver acima de 55%, se faz necessária a correção do volume de anticoagulante para a coleta do sangue.
Questão 4: A resposta é a opção 3. Após a coleta o material deve ser identificado e enviado imediatamente ao laboratório em temperatura ambiente. As temperaturas extremas devem ser evitadas para a manutenção da integridade da amostra.
De acordo com os centros de referência, as amostras destinadas aos testes de função plaquetária não devem ser transportadas por sistema pneumático ou transporte motorizado por causarem a ativação das plaquetas durante o percurso. O sangue deve ser coletado próximo ao laboratório que realiza o exame.
A agregação plaquetária tanto por sistema óptico como por impedância deve ser realizada entre 15 a 30 minutos após a preparação do plasma rico em plaquetas (PRP) ou após a coleta do sangue, por impedância. As amostras devem ser mantidas em temperatura ambiente, e o teste finalizado dentro de 3 a 4 horas.
O ajuste da transmitância do agregômetro de 0 a 100% de amplitude antes do início da agregação deve ser realizado com o plasma autólogo do paciente que atua como o branco da reação.
Questão 5: A resposta é a opção 1. De acordo com alguns autores, a resposta de agregação plaquetária sofre pouca influência quando o número de plaquetas do PRP varia entre 200 mil/mm³ a 600 mil/mm³. O reajuste do número de plaquetas do PRP deve ser realizado quando exceder a 600 mil/mm³, com solução fisiológica e não com plasma autólogo. A justificativa dessa mudança é devido à liberação de ADP por eritrócitos e plaquetas durante a centrifugação em alta rotação para a obtenção do plasma autólogo pobre em plaquetas.
O ADP presente no plasma promove a dessensibilização dos receptores plaquetários específico do agente resultando em diminuição de resposta de agregação.
Questão 6: A resposta é a opção 4. As soluções estoque devem ser mantidas conforme instruções do fabricante e o volume utilizado na agregação plaquetária não devem exceder a 10% do volume do PRP para não ocorrer diluição das plaquetas. As soluções de uso devem permanecer em banho de gelo, homogeneizadas, se possível em vórtex, exceto o colágeno que além de não poder ser congelado e sua homogeneização deve ser delicada.
Questão 7: A resposta é a opção 2. A escolha dos reagentes para a investigação depende da suspeita clínica. Um exemplo é a doença trombastenia de Glanzmann que apresenta diminuição ou ausência do complexo glicoproteíco IIb-IIIa plaquetário (GPIIb-IIIa). Para o diagnóstico laboratorial, os agentes agregantes empregados são ADP, ADR, ácido araquidônico (AA) e colágeno cuja agregação é dependente do complexo GPIIb-IIIa. O reagente ristocetina não é indicado nesse caso, pois o mecanismo de ação é modificar a estrutura FVW para melhor interagir com a glicoproteína Ib da plaqueta. A ristocetina deve ser utilizada no auxílio de diagnóstico de síndrome de Bernard Soulier (deficiência ou ausência do complexo GPIb-IX-V), diferenciação da DVW do tipo 2A, 2M de 2B e pseudoDVW.
O laboratório deve estabelecer os intervalos de referência de normalidade e validar o teste para cada lote e concentração do reagente utilizado.
Quando o parâmetro de avaliação da agregação plaquetária for a amplitude de agregação, mesmo com o estabelecimento prévio dos valores normais de referência (no mínimo n= 20), é importante observar o perfil das curvas de agregação. É possível que a amplitude de agregação esteja dentro dos valores de referência, mas com a ausência de segunda onda.
Questão 8: A resposta é a opção 3. A dose-resposta de agregação plaquetária dos agentes agregantes difere de indivíduo para indivíduo, evidentemente em determinada faixa de concentração. A curva de agregação de plaquetas normais com ADP nas concentrações de 2,5 até 10 µM pode apresentar duas ondas distintas ou fundidas. Podem-se encontrar plaquetas com função normal, mas com apenas a primeira onda nas doses de 2,5 e 5 µM, porém quando a dose é aumentada para 10 µM as duas ondas se formam normalmente e as plaquetas desse paciente são consideradas normoagregantes.
A resposta de primeira onda agregação plaquetária com ADP é dependente dos receptores específicos, P2Y12, P2Y1 e P2X1 bem como do complexo glicoproteico GPIIb-IIIa. O complexo GPIb-IX se liga ao fator de von Willebrand na adesão plaquetária. Na doença de von Willebrand as plaquetas têm função normal quando ativadas com ADP, Epinefrina, ácido araquidônico e colágeno.
Questão 9: A resposta é a opção 1. Se o indivíduo apresentar somente hipoagregabilidade com epinefrina sem manifestação hemorrágica, o resultado não tem relevância. De acordo com os expertises em plaquetopatias, a disfunção plaquetária deve ser considerada quando houver alteração de resposta de dois ou mais agentes agregantes e o padrão se repetir em outra ocasião.
A resposta de agregação plaquetária com epinefrina é dependente do receptor específico α- adrenérgico e sua resposta pode ser mais lenta o que não significa alteração de função das plaquetas. Muitas vezes a resposta de segunda onda se inicia próximo de 10 minutos após a adição do agente. A epinefrina é um agente agregante fraco e depende das vias das enzimas cicloxigenase e tromboxano sintase para a formação do tromboxano A2 (TXA2).
Questão 11: A resposta é a opção 3. A trombastenia de Glanzmann (TG) é um distúrbio da função plaquetária causada por uma anomalia nos genes das glicoproteínas IIb / IIIa. A ausência da quantidade e/ou da função leva a ausência de agregação, já que as plaquetas utilizam esses receptores para se ligarem umas às outras tendo como ponte o fibrinogênio ou fator von Willebrand (em condições de alta força de cisalhamento). A trombastenia de Glanzmann é uma doença autossômica recessiva, o que significa que ambos os pais devem ser portadores de um gene anormal (embora eles próprios não tenham a doença) e, mas transmitem esse gene anormal ao seu filho. Como todos os transtornos autossômicos recessivos, a maior frequência é encontrada em regiões do mundo onde o casamento entre parentes próximos é comum.
As manifestações clínicas variam de um indivíduo para outro, desde um leve sangramento até quadros hemorrágicos graves. Os sintomas são observados desde a infância e incluem: epistaxe; menorragia; sangramento de gengiva; sangramento gastrointestinal; sangramento anormal após a realização de procedimentos cirúrgicos, como a circuncisão, procedimento odontológicos.
O diagnóstico deve englobar o histórico clínico do paciente e os testes laboratoriais que avaliam a função das plaquetas dependentes de GPIIb-IIIa , como agregação plaquetária com ADP, Epinefrina, Colágeno. A agregação plaquetária na TG com tais agentes agregantes está ausente, mas com ristocetina é normal devido a presença das GPIb-IX. Como teste confirmatório da ausência de GPIIb-IIIa é realizado o teste de citometria de fluxo com o monoclonal CD41a.
Questão 12: A resposta é a opção 2. Nos sinais e sintomas do paciente, nos resultados dos testes de triagem e confirmatórios (agregação plaquetária e outros), após repetição dos testes e com reprodutibilidade dos resultados.
Questão 13: A resposta é a opção 2. A Síndrome de Bernard-Soulier é uma doença hemorrágica hereditária rara devida a uma diminuição da capacidade de adesão das plaquetas, o que compromete o início da formação do coágulo. É caracterizada por uma redução moderada no número de plaquetas circulantes e pela presença de plaquetas gigantes. A anomalia da adesão plaquetária é devida à diminuição ou ausência do complexo GPIb-V-IX na sua membrana. A transmissão é autossômica recessiva e os portadores são, em geral, assintomáticos. Um casal de portadores tem, em cada gravidez, 25% de probabilidade de ter um filho com a Síndrome de Bernard-Soulier.
Os pacientes com Bernard-Soulier têm maior tendência a hemorragias das mucosas. O diagnóstico é feito habitualmente nos primeiros anos de vida na sequência do aparecimento de equimoses, epistaxe ou hemorragias gengivais ou, mais tarde, por hemorragias abundantes após extrações dentárias, traumatismos, cirurgias ou por menorragias abundantes ou na sequência de estudos familiares.
O diagnóstico laboratorial consiste: plaquetopenia com presença de plaquetas gigantes; tempo de sangramento prolongado; agregação plaquetária diminuída com ristocetina e normal com os outros agentes agregantes de plaquetas (ADP, epinefrina, colágeno e ácido araquidônico).
Como alguns subtipos da doença de von Willebrand (2A , 2M, Tipo I grave e tipo 3) também cursam com diminuição de resposta à ristocetina, o teste laboratorial diferencial dessas duas patologias é a adição de crio precipitado ou plasma bovino, ricos em FVW, na agregação plaquetária com ristocetina. Se as plaquetas passarem a responder à ristocetina significa que o paciente apresenta deficiência de FVW, caso contrário, é caracterizada a deficiência das GPIb/IX/V.
A alternativa 3 é incorreta porque a ingestão de ácido acetilsalicílico (AAS) inibe a segunda e não a primeira onda de agregação por sistema óptico com os agentes agregantes epinefrina, ADP e colágeno em baixas doses. No caso de ativação com AA, há inibição completa de agregação. Isso é devido a acetilação da cicloxigenase pelo AAS, bloqueando-a de forma irreversível. Em condições normais, a enzima metaboliza o substrato, ácido araquidônico com produção de tromboxano A2 que além de potente agente vasoconstritor é quimiotático, ou seja, chama outras plaquetas para o local. A liberação do conteúdo dos grânulos e a produção de TXA2 levam a formão da segunda onda de agregação plaquetária, in vitro.
Questão 14: A resposta é a opção 4. As alternativas corretas são: O método de impedância é uma boa ferramenta para avaliação da resposta plaquetária dos pacientes que fazem uso de drogas antiplaquetárias, pois avalia a interação das plaquetas, leucócitos e eritrócitos, mimetizando o que ocorre “in vivo”; O agente agregante AA detecta a presença de AAS na amostra tanto por sistema óptico como por impedância. Porém diferentemente do sistema óptico, o sistema de impedância não discrimina a deficiência das glicoproteínas IIb-IIIa de deficiência de cicloxigenase devido a forma em que avalia a agregação. A agregação das plaquetas por impedância é medida por aumento da resistência elétrica. À medida que as plaquetas são ativadas com o agente agregante se ligam ao eletrodo de platina, mergulhado no sangue total ou em PRP. As plaquetas liberam substâncias quimiotáticas que atraem outras células formando um agregado sobre o eletrodo. Essa metodologia não distingue primeira e segunda onda, apenas o aumento de resistência elétrica.
Questão 15: A resposta é opção 3.
Na alternativa 1: “Os resultados de agregação plaquetária do paciente sugerem deficiência de GPIIb-IIIa (TG).” Nesse caso não haveria a formação da primeira onda de agregação.
Alternativa 2: “Os resultados de agregação plaquetária do paciente sugerem presença de AAS na amostra”. De acordo com as curvas não houve formação de segunda onda quando os estímulos foram ADP; Epinefrina; e colágeno em baixa dose. Esses resultados são sugestivos de presença de AAS, mas a resposta com AA foi normal, revelando que a enzima cicloxigenase está livre para metabolizar esse substrato.
A alternativa correta 3 – “Os resultados de agregação plaquetária do paciente sugerem defeito na liberação plaquetária”. Geralmente os defeitos plaquetários de secreção do conteúdo intragranular, principalmente de grânulo denso, cursam com ausência de segunda onda quando o estímulo é o ADP, epinefrina, colágeno e normal com AA é normal. Apenas a produção do TXA2 que não é suficiente para a manutenção da segunda onda de agregação. A falta de secreção plaquetária pode acarretar manifestações hemorrágicas leves ou moderadas.
O método alternativo de avaliação de secreção de grânulo denso é a liberação do nucleotídeo ATP em paralelo à agregação plaquetária. O mercado conta com um equipamento que avalia, ao mesmo tempo a agregação e a liberação de ATP (estocado no grânulo denso da plaqueta) por luminescência com a utilização do sistema enzimático, luciferina / luciferase. A liberação do ATP por essa metodologia pode ser realizada tanto em PRP como em sangue total.
O ATP liberado dos grânulos densos, em resposta ao agente agregante reage com luciferina na presença da enzima luciferase emitindo luz que é rapidamente captada. A resposta é comparada a um padrão de ATP de concentração conhecida.
De acordo com alguns autores a falta de liberação pode ser devido à ausência de grânulo plaquetário, a falta do conteúdo dos grânulos ou problemas na transdução de sinal resultando em impossibilidade de liberação. O diagnóstico final é esclarecido apenas por microscopia eletrônica.
Quanto à alternativa 4 – “Os resultados de agregação plaquetária do paciente sugerem a investigação da doença de von Willebrand”. Só é possível suspeitar de von Willebrand quando o paciente apresentar hipo ou hiper agregabilidade com ristocetina, mas sempre com avaliações prévias da atividade e o antígeno do FVW.
Gabarito
Pergunta 1 – Opção 4
Pergunta 2 – Opção 3
Pergunta 3 – Opção 4
Pergunta 4 – Opção 3
Pergunta 5 – Opção 1
Pergunta 6 – Opção 4
Pergunta 7 – Opção 2
Pergunta 8 – Opção 3
Pergunta 9 – Opção 1
Pergunta 10 – Opção 4
Pergunta 11 – Opção 3
Pergunta 12 – Opção 2
Pergunta 13 – Opção 2
Pergunta 14 – Opção 4
Pergunta 15 – Opção 3
Elaboradora: Tania Rubia Flores da Rocha. Farmacêutica Bioquímica (USP); mestrado em Análises Clínicas (USP); Chefe do Laboratório de Hemostasia do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da faculdade de Medicina – USP; Membro da Comissão de Laboratório de Hemostasia do Ministério da Saúde.
Referências Bibliográficas:
-
- Roberts JC, Flood VH. Laboratory diagnosis of von Willebrand disease. Int. Jnl. Lab. Hem. 2015, 37 (Suppl. 1), 11–17.
- Favaloro EJ, Bonar R, Chapman K, Meiring M, Funk Adcock D. Differential sensitivity of von Willebrand factor (VWF) ‘activity’ assays to large and small VWF molecular weight forms: a cross-laboratory study comparing ristocetin cofactor, collagen-binding and mAb-based assays. J Thromb Haemost. 2012 Jun;10(6):1043-54.
- Bolton-Maggs PH, Favaloro EJ, Hillarp A, Jennings I, Kohler HP. Difficulties and pitfalls in the laboratory diagnosis of bleeding disorders. Haemophilia. 2012 Jul;18 Suppl 4:66-72.
- Saraiva, ASL; Sternick, GMP; Santos, ME; Montalvão, SAL; Machado, TFGS; Rocha, TRF. Manual de diagnóstico laboratorial das Coagulopatias Hereditárias e Plaquetopatias. Ministério da Saúde – Brasília-DF. 2012.
- Favaloro EJ. Diagnosis and classification of von Willebrand disease: a review of the differential utility of various functional von Willebrand factor assays. Blood Coagul Fibrinolysis. 2011 Oct;22(7):553-64.
- Manual de diagnóstico e tratamento da doença de Von Willebrand. MINISTÉRIO DA SAÚDE Secretaria de Atenção à Saúde Departamento de Atenção Especializada 2008.