A seguir são comentadas as questões para as quais foram recebidas mais dúvidas quando disponibilizadas para os usuários Controllab
Pergunta 1: A resposta é a opção 4. Não há relatos de prolongamentos do TP e TTPA na gravidez, pelo contrário, os níveis de Fator VIII e FVW estão aumentados nessa condição. Dependendo da elevação do fator VIII, o TTPA encontra-se encurtado.
Não há relatos na literatura quanto a diferenças nos valores de normalidade do TP e TTPA quanto ao sexo e raça.
Pergunta 2: A resposta é a opção 3. A paciente sem queixa de sangramento ao longo da vida já é uma observação importante para descartar as alternativas:
Hemofilia – hemofilia é uma doença muito rara em mulheres, acomete o sexo masculino. A paciente em questão poderia ser portadora de hemofilia, porém a grande maioria das portadoras apresentam TTPA normal.
Uso de anticoagulante oral anti-vitamina K – esses anticoagulantes alteram principalmente o Tempo de Protrombina (TP) e dependendo dos níveis de anticoagulante circulante podem alterar também o TTPA.
Problemas com a coleta de sangue – dependendo do acesso venoso do paciente, a coleta pode ser traumática, promovendo a ativação da coagulação in vitro, e consequentemente o prolongamento, principalmente do TTPA.
Jejum de 4 horas – tempo recomendado de jejum para os testes de hemostasia.
Pergunta 3: A reposta é a opção 4. A adição no tubo de coleta um volume menor de sangue acarreta em diluição de todos os fatores de coagulação (anticoagulante em excesso) e consequentemente o prolongamento do TTPA; diminuição dos níveis plasmáticos do Fator Willebrand:Ag, Cofator de Ristocetina e do fator VIII:C. A proporção correta de sangue e anticoagulante para os testes de hemostasia é de 9 volumes de sangue para 1 volume de citrato de sódio 3,2%.
Pergunta 4: A resposta é a opção 2. O volume de anticoagulante deve ser eficaz para bloquear a ativação da cascata da coagulação, in vitro. A proporção está estabelecida para o sangue cujo valor do hematócrito varie até 55%, sendo 9 partes de sangue para 1 parte de anticoagulante. Em casos de hematócrito com valor acima de 55%, o volume de citrato de sódio estará em excesso em relação ao volume de plasma. Consequentemente pode ocorrer falsa elevação dos tempos dos testes de coagulação. Para evitar falsos resultados, deve se ajustar o volume de citrato de sódio, empregando-se a seguinte fórmula de correção:
C= (1,85 x 10-³) (100 HCT) x (V sangue)
C = Volume de citrato de sódio 3,2%
HCT = Valor do hematócrito do paciente
V = Volume de sangue adicionado (se o tubo for de 5 mL, então o volume será 4,5 mL).
Para o hematócrito com valor abaixo de 30%, não há informações disponíveis que sustentem uma recomendação específica (Manual de diagnóstico laboratorial das coagulopatias hereditárias e plaquetopatias –Ministério da Saúde 2012)
Pergunta 5: A resposta é a opção 2. Os testes de função plaquetária exigem cuidados especiais em todas as fases que antecedem a emissão do resultado. As plaquetas se ativam com muita facilidade, in vitro, liberando para o meio externo, o conteúdo dos seus grânulos (alfa, denso, lisossomais). Mesmo o laboratório adotando os devidos cuidados na coleta, transporte, processamento, os agonistas e a concentração empregada, o teste de agregação plaquetária tem alto coeficiente de variação (20 -40%). É importante a realização do teste o mais rápido possível evitando, além da ativação in vitro, o sequestro de íons cálcio intracelular que leva a hipofunção “função dessas células”. As baixas temperaturas também podem interferir na atividade das plaquetas, promovendo ativação, inicialmente. Todos os procedimentos envolvendo plaquetas devem ser realizados em temperatura ambiente com utilização de material plástico. O vidro tem carga negativa e ativa tanto as plaquetas como os fatores de coagulação.
De acordo com os guidelines de função plaquetária o tempo máximo recomendado entre a coleta do sangue e realização do teste é no máximo 4 horas.
Pergunta 6: A resposta é a opção 3. O Anticoagulante Lúpico é uma imunoglobulina que se liga um complexo de proteína e fosfolípide, complexo esse associado à membrana celular. In vivo, a presença desses anticorpos pode levar a episódios tromboembólicos, mas in vitro, prolonga os testes de coagulação dependentes de fosfolípides. Por isso o nome de anticoagulante, e lúpico porque foi descrito pela primeira vez em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.
O plasma citratado para a realização dos testes de triagem e confirmatórios deve ser livre de plaquetas menos que 10.000 plaquetas /mm³, devido a grande quantidade de fosfolípides presentes na membrana. Os guidelines recomendam a dupla centrifugação do plasma para a retirada total das plaquetas.
A pesquisa de anticoagulante lúpico é realizada por testes indiretos de coagulação como: Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA), veneno de víbora de Russell diluído (dRVVT), Sílica coloidal, Tromboplastina diluída (TTI) e outros. Esses testes são realizados com baixa concentração de fosfolípides (teste de triagem) e excesso de fosfolípide (teste confirmatório). A adição de excesso de fosfolípide neutraliza o anticorpo ou dessensibiliza o teste na detecção, corrigindo ou encurtando o tempo de coagulação. O teste confirmatório é necessário para diferenciar a presença de anticorpos específicos que também prolongam o tempo de coagulação, mas não corrigido ou encurtado na presença de excesso de fosfolípide.
Como descrito acima, os testes de detecção de anticoagulante lúpico são indiretos e realizados por método de coagulação. Portanto é necessário que os fatores de coagulação sejam preservados. Sendo assim, o plasma teste deve ser mantido nas mesmas condições dos testes que pesquisam os níveis plasmáticos de fatores de coagulação. A opção da alternativa 4 é inadequada, principalmente quando são utilizados os testes de pesquisa, TTPA e dRVVT em que são sensíveis aos fatores lábeis VIII e V, respectivamente.
Pergunta 7: A resposta é a opção 4. A investigação laboratorial da doença de Von Willebrand inclui os seguintes testes: Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada, determinação da atividade do fator VIII e do fator Von Willebrand (Cofator de Ristocetina) e determinação do fator Von Willebrand antígeno. O processamento e os cuidados com a amostra são os mesmos para os testes de coagulação.
Para evitar a formação de crioprecipitado, que ocorre em baixas temperaturas (cristalização do fator VIII, fibrinogênio e fator Von Willebrand), o material deve ser centrifugado em temperatura ambiente. Se a determinação de fator VIII, FVW:Ag e Cofator de Ristocetina forem realizados logo após a separação, o plasma também deve ser mantido em temperatura ambiente. Caso contrário, o plasma deve ser congelado imediatamente e mantido a -35ºC por até 15 dias ou por 6 meses ou mais, a -70ºC. O descongelamento do plasma também deve ser rápido, a 37 ºC por 5 minutos.
Pergunta 8: A resposta é a opção 2. A hemólise do sangue, in vitro, pode ser ocasionada por vários fatores, tais como, tapinhas na veia a ser puncionada; coletas traumáticas e demoradas; excesso de homogeneização após a coleta – agitação; garroteamento prolongado; inserção da agulha da seringa na tampa dos tubos; velocidade de centrifugação e/ou tempo excessivos; transporte inadequado (agitação e tempo); armazenamento inadequado; contato do sangue total com gelo. Todos esses fatores podem levar a ruptura de hemácias e consequentemente a liberação dos componentes intracelulares que ativam a coagulação, assim como os fosfolípides de membrana rompida. Além disso, ocorre a diluição do plasma por liberação do conteúdo citoplasmático. Portanto amostras hemolisadas, in vitro, devem ser descartadas, exceto se o paciente apresentar doença hemolítica.
Pergunta 9: A resposta é a opção 4. (Idem acima) A hemólise do sangue, in vitro, pode ser ocasionada por vários fatores, tais como, tapinhas na veia a ser puncionada; coletas traumáticas e demoradas; excesso de homogeneização após a coleta – agitação; garroteamento prolongado; inserção da agulha da seringa na tampa dos tubos; velocidade de centrifugação e/ou tempo excessivos; transporte inadequado (agitação e tempo); armazenamento inadequado; contato do sangue total com gelo. Todos esses fatores podem levar a ruptura de hemácias e consequentemente a liberação dos componentes intracelulares que ativam a coagulação, assim como os fosfolípides de membrana rompida. Além disso, ocorre a diluição do plasma por liberação do conteúdo citoplasmático. Portanto amostras hemolisadas, in vitro, devem ser descartadas, exceto se o paciente apresentar doença hemolítica.
Pergunta 10: A resposta é a opção 3. A sequência incorreta de tubos para a coleta de testes de hemostasia pode ocasionar a contaminação com outros anticoagulantes que alteram expressivamente os testes de coagulação. São eles, EDTA, Heparina e também os ativadores de coagulação que aceleram a obtenção de soro.
A ordem correta de coleta: primeiramente o tubo contendo citrato de sódio e depois os outros tubos.
O descarte do primeiro tubo de coleta só é necessário em caso de teste de agregação plaquetária e em veias de difícil acesso.
O calibre da agulha deve acompanhar o da veia do paciente. Geralmente é utilizado o calibre 21 para adultos e 23 para crianças. Agulhas de baixo calibre podem promover hemólise, formação de coágulos e as mais calibrosas, ativação da coagulação e das plaquetas.
O garroteamento do braço do paciente deve ser feito com o garrote de fita, e permanecer no máximo 1 minuto até a punção venosa. Caso contrário, o garroteamento prolongado induz estase do sangue e aumenta os níveis plasmáticos do fator Von Willebrand, Fator VIII e ativadores do plasminogênio.
Mesmo a coleta sendo feita com tubo a vácuo, o sangue deve ser homogeneizado por inversão 5 a 7 vezes, delicadamente.
Pergunta 11: A resposta é a opção 4. A amostra de sangue total pode ser armazenada em temperatura ambiente somente para a realização do Tempo de Protrombina (TP). Porém, tanto o plasma quanto o sangue total se mantidos em geladeira (2 – 8ºC), o fator VII é ativado pelo sistema de contato da coagulação, principalmente pela pré-calicreína.
Para a realização do TTPA, tanto o sangue total quanto o plasma podem ser mantidos refrigerados ou em temperatura ambiente por no máximo 4 horas, sem alteração dos resultados.
Os mesmos cuidados para o TTPA devem ser adotados para a determinação do fator VIII: C, porém, se o plasma for congelado e mantido a -35 ºC o limite de estoque é de duas semanas, se a -70ºC acima de 6 meses com a preservação da atividade do fator VIII:C e outros.
Pergunta 12: Sobre essa questão algumas observações já foram feitas na questão anterior em relação à estabilidade do fator VIII:C de plasma congelado.
O congelamento do plasma deve ser rápido e não lento como afirma a alternativa 1. A rapidez do congelamento evita a perda de atividade dos fatores de coagulação. É recomendado o congelamento das amostras de plasma com nitrogênio líquido ou gelo seco e álcool ou preparar alíquotas em pequenos volumes (± 0,5 mL) congelando-as em freezer a -70ºC. A estabilidade da atividade do fator Von Willebrand, quando a amostra é congelada e mantida a -70°C, é de 6 a 12 meses sem perda de função.
Ao contrário da afirmação da alternativa 2, o fibrinogênio é um fator de coagulação estável após infusão na circulação e apresenta uma meia vida de 90 horas.
O descongelamento da amostra de plasma deve ser rápido em temperatura de 37º C durante 5 minutos ou mais se o volume de amostra de plasma for grande (acima de 2 mL) para a estabilização da molécula de fibrinogênio.
Pergunta 13: A resposta é a opção 1. Se as distâncias forem menores com tempo reduzido de transporte de até 3 horas, as amostras sem processamento ou processadas é recomendado o envio em temperatura ambiente. A amostra se enviada congelada e mantida em gelo, pode descongelar no trajeto. Dois ou mais ciclos de congelamento e descongelamento do plasma implicam em perda dos fatores de coagulação. O sangue total não pode ser congelado para qualquer procedimento laboratorial de hemostasia.
Pergunta 14: A resposta é a opção 3. As plaquetas se degranulam com muita facilidade, o que causa perda da sua atividade. Durante o procedimento de obtenção do plasma rico em plaquetas realizado em baixa rotação (± 1000 rpm) por 10 minutos para o teste de agregação plaquetária por sistema óptico, pode-se detectar níveis significativos de conteúdo intragranular liberado durante a centrifugação. Portanto, o transporte do material para outro local distante em que é realizado o teste, principalmente com transporte motorizado, pode ocorrer ativação plaquetária importante, mascarando os resultados. Portanto, o material deve ser colhido no mesmo local em que for realizado o teste sem agitação. Há alguns programas de qualidade que são rigorosamente contra ao transporte pneumático das amostras pra teste de função plaquetária. Podem ser obtidos mais esclarecimentos no documento Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function do British Committee for Standards in Haematology com todas as recomendações para a realização dos testes destinados à função plaquetária. O anticoagulante utilizado para a avaliação da função das plaquetas é o citrato de sódio 3,2%. A heparina pode aumentar a função e não é recomendada.
Pergunta 15: A resposta é a opção 2. Como foi abordado na introdução, a fase pré-analítica abrange tanto as variáveis de coleta, transporte, preparo e armazenamento das amostras e as variáveis do paciente como condições fisiológicas, fisiopatológicas e medicamentos.
Nessa questão foi abordada a variável do paciente, que em condição inflamatória pode apresentar alterações na hemostasia. Muitas vezes, para a obtenção do diagnóstico laboratorial de doença relacionada a distúrbio hemostático, é necessária a repetição da coleta de sangue do paciente em outra ocasião após os quadros inflamatórios e ou infecciosos.
O fator VIII: C, Fibrinogênio e Fator Von Willebrand (quantidade e função) são proteínas de fase aguda e, portanto, se elevam em todas as situações que envolvem dano, infecção ou inflamação tissular (neoplasias, pós-operatórios e síndrome nefrótica) o que também ocorre na gestação.
Gabarito
Pergunta 1 – Opção 4
Pergunta 2 – Opção 3
Pergunta 3 – Opção 4
Pergunta 4 – Opção 2
Pergunta 5 – Opção 2
Pergunta 6 – Opção 3
Pergunta 7 – Opção 4
Pergunta 8 – Opção 2
Pergunta 9 – Opção 4
Pergunta 10 – Opção 3
Pergunta 11 – Opção 4
Pergunta 12 – Opção 3
Pergunta 13 – Opção 1
Pergunta 14 – Opção 3
Pergunta 15 – Opção 2
Elaborador: Tania Rubia Flores da Rocha. Farmacêutica Bioquímica (USP); mestrado em Análises Clínicas (USP); Chefe do Laboratório de Hemostasia do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da faculdade de Medicina –USP; Membro da Comissão de Laboratório de Hemostasia do Ministério da Saúde.
Referências Bibliográficas:
CLSI/NCCLS H21A5 Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing PlasmaBased Coagulation Assays 2008
Favaloro, EJ; Funk, DM; Lippi, G. Pre-analytical Variables in Coagulation Testing Associated With Diagnostic Errors in Hemostasis. DOI: 10.1309/LM749BQETKYPYPVM. 2012.
Saraiva, ASL; Sternick, GMP; Santos, ME; Montalvão, SAL; Machado, TFGS; Rocha, TRF. Manual de diagnóstico laboratorial das Coagulopatias Hereditárias e Plaquetopatias. Ministério da Saúde – Brasília-DF. 2012.